Шифф йодная кислота

Шифф йодная кислота

Периодная кислота – Шифф ( PAS ) — это метод окрашивания, используемый для обнаружения в тканях полисахаридов, таких как гликоген , и слизистых веществ, таких как гликопротеины , гликолипиды и муцины. Реакция периодической кислоты окисляет вицинальные диолы в этих сахарах , обычно разрывая связь между двумя соседними атомами углерода, не участвующими в гликозидной связи или замыкании кольца в кольце моносахаридных единиц, которые являются частью длинных полисахаридов, и создавая пару из альдегидов на два свободных концах каждого сломанного моносахаридакольцо. Условия окисления должны в достаточной мере регулироваться, чтобы не окислять альдегиды в дальнейшем. Эти альдегиды затем реагируют с реактивом Шиффа, давая пурпурно-пурпурный цвет. Подходящее базовое пятно часто используется как контрастное пятно .

• Окраска диастазы PAS (PAS-D) — это окраска PAS, используемая в сочетании с диастазой , ферментом , расщепляющим гликоген.

• Альциановый синий / периодическая кислота — Шифф (AB / PAS или AB-PAS) использует альциановый синий перед шагом PAS.

Содержание

  • 1 Использует
  • 2 Смотрите также
  • 3 Ссылки
  • 4 внешние ссылки

Использует

Окрашивание PAS в основном используется для окрашивания структур, содержащих высокую долю макромолекул углеводов ( гликоген , гликопротеин , протеогликаны ), обычно обнаруживаемых, например, в соединительных тканях , слизи , гликокаликсе и базальных пластинках .

Окрашивание PAS может использоваться для диагностики нескольких заболеваний:

  • Болезнь накопления гликогена (по сравнению с другими нарушениями накопления).
  • Аденокарциномы , которые часто выделяют нейтральные муцины.
  • Болезнь Педжета груди .
  • Саркома альвеолярной мягкой части .
  • Окрашивание макрофагов при болезни Уиппла .
  • Его можно использовать для диагностики дефицита α1-антитрипсина при положительном окрашивании перипортальных гепатоцитов печени.
  • Агрегаты PAS-положительных лимфоцитов присутствуют в эпидермисе при грибковом микозе и синдроме Сезари , которые называются микроабсцессами Путрие.
  • Саркома Юинга
  • Эритролейкоз , лейкоз незрелых эритроцитов. Эти клетки окрашивают в яркий фуксию.
  • Легочный альвеолярный протеиноз .
  • Грибковаяинфекция , клеточные стенки грибов окрашиваются в пурпурный цвет; это работает только с живыми грибами. В отличие от этого, окрашивание метенамином серебра (GMS) Grocott окрашивает как живые, так и мертвые грибковые организмы.
  • Он используется для определения гликогена в образцах биопсии легких у младенцев с легочным интерстициальным гликогенозом (PIG).
  • Его можно использовать для выделения суперсшитых липидных включений при цероидном липофусцинозе (NCL).

Присутствие гликогена можно подтвердить на срезе ткани, используя диастазу для переваривания гликогена из среза, а затем сравнивая срез PAS, расщепленный диастазой, с нормальным срезом PAS. Слайд с отрицательной диастазой покажет пурпурное окрашивание там, где гликоген присутствует в срезе ткани. На предметном стекле, обработанном диастазой, не будет положительного окрашивания PAS в тех местах на предметном стекле.

Окрашивание PAS также используется для окрашивания целлюлозы . Одним из примеров может быть поиск имплантированных медицинских устройств, состоящих из неокисленной целлюлозы.

Если окрашивание PAS будет производиться на ткани, рекомендуемым фиксатором будет 10% формалин с нейтральным буфером или раствор Буэна . Для мазков крови рекомендуемый фиксатор — метанол . Глутаральдегид не рекомендуется, поскольку свободные альдегидные группы могут вступать в реакцию с реагентом Шиффа , что может привести к ложноположительному окрашиванию.

Реакция Фельгена с реактивом Шиффа на ДНК

Реакция Фельгена указывает на присутствие ДНК, поэтому она прежде всего может быть использована для констатации наличия или отсутствия ядер в клетках, их размеров, формы, местоположения и т. д. Кроме того, интенсивность окрашивания может дать косвенные указания на количественные изменения ДНК.

Реактив Шиффа — фуксинсернистая кислота — является характерным реактивом на альдегиды. На свойстве реактива Шиффа взаимодействовать с альдегидными группами основана и реакция Фельгена с этим реактивом на ДНК. Однако, ввиду того что в молекуле ДНК альдегидные группы связаны, их надо предварительно освободить. Это достигается проведением гидролиза ДНК слабой кислотой, в результате которого происходит отщеплейие пуриновых оснований (аденина, гуанина) от молекулы ДНК и образуется остаток молекулы ДНК со свободными альдегидными группами:

Изменения возникают у первого углеродного атома дезоксирибозы; в месте отрыва пуриновых оснований выявляется потенциальная альдегидная группа. При. этом фуранозная форма дезоксирибозы превращается в форму нециклического сахара. В процессе реакции к двум альдегидным группам дезоксирибозы присоединяется одна молекула фуксинсернистой кислоты.

Фуксинсернистая кислота (лейкофуксин) получается из кислого раствора основного фуксина (парафуксина) в 1 н. соляной кислоте при насыщении его сернистым ангидридом. Сернистый ангидрид образуется при взаимодействии соляной кислоты с бисульфитом натрия, которые вносятся в кислый раствор основного фуксина:

При пропускании сернистого газа в раствор фуксина нарушаются две двойные связи, в одном из трех ароматических колец фуксина исчезает хиноидная группировка, а вместе с ней и лилово-красная окраска, свойственная фуксину. Фуксинсернистая кислота — непрочное бесцветное соединение.

Читайте также:  Гной из глаза новорожденного причины

Получение фуксинсернистой кислоты из основного фуксина протекает следующим образом: фуксин, взаимодействуя с соляной кислотой, образует комплексное соединение, которое далее реагирует с сернистой кислотой по следующей схеме:

Таким образом, при образовании фуксинсернистой кислоты к фуксину присоединяются две группы (-SO2H).

При реакции с альдегидами хиноидная группировка восстанавливается, так как фуксинсернистая кислота — неустойчивое соединение, разлагается с образованием сернистой кислоты.

При взаимодействии одной молекулы фуксинсернистой кислоты с двумя молекулами остатков ДНК, имеющих обнаженные альдегидные группы, получается одна молекула окрашенного соединения.

При подготовке материала для проведения реакции Фельгена обычно рекомендуют фиксацию в спиртовых и кислых фиксаторах. Чаще всего применяют фиксатор Карнуа (стр. 45). Такой фиксатор осаждает нуклеопротеиды, что приводит к удачным морфологическим картинам. Однако длительное пребывание материала в фиксаторе вызывает разрушение связи между нуклеиновыми кислотами и белками, приводит к постепенной экстракции нуклеиновых кислот и дает искаженную картину. Поэтому пребывание в фиксаторе надо максимально ограничивать.

1) Реактив Шиффа (фуксинсернистая кислота).

Приготовление реактива Шиффа. 1 г основного фуксина растереть в ступке и растворить в 200 мл кипящей дистиллированной воды; охладить до 50°С. В охлажденный раствор добавить 20 мл 1 н. соляной кислоты * и охладить до 25°С. Добавить 1 г бисульфита или метабисульфита натрия. Полученную смесь взболтать с активированным углем (от 1 да 3 мин) и профильтровать. Налить в темный или завернутый в темную бумагу сосуд, закрыть его притертой пробкой и поместить в темноту на 12 или более часов до обесцвечивания основного фуксина и образования фуксинсернистой кислоты.

* ( 1 н. соляная кислота соответствует 10%-ному раствору, приготовленному из концентрированной соляной кислоты (уд. в. 1,19))

2) Сернистая вода.

Приготовление сернистой воды. К 200 мл дистиллированной воды добавить 20 мл 1 н. соляной кислоты и 1 г бисульфита натрия.

3) 1 н. соляная кислота.

4) Среды для обезвоживания объектов и заключения их в канадский бальзам (стр. 66-70).

5) Канадский бальзам.

Проведение реакции

* ( См. сноску на стр. 118.)

1. Погрузить препараты в 1 н. соляную кислоту на несколько секунд.

2. Перенести их в заранее нагретую до 60° С 1 н. HCl и поместить в термостат при температуре 60° С (или на водяную баню с такой же температурой) на 5-10 мин * .

* ( Длительность гидролиза зависит от примененного фиксатора. При употреблении фиксатора Карнуа и формалина оптимальное время 8 мин.)

3. Сполоснуть препараты холодной 1 н. HCl.

4. Поместить их в реактив Шиффа на 1 ч.

5. Отмыть избыток реактива Шиффа сернистой водой (3 смены по 3-5 мин).

6. Промывать препараты в водопроводной воде в течение 5-10 мин, сменяя начинающую розоветь воду.

7. Довести препараты до бальзама через 96%-ный, 100%-ный спирт, смесь спирта с ксилолом и ксилол.

8. Наблюдать появление малиновой окраски.

Результаты реакции (табл. 20)


Таблица 20. Реакция Фельгена. Кончик корешка лука. А — общий вид кончика корешка лука в разрезе; Б — детали строения кончика порошка лука; 1 — корневой чехлик; 2 — зона деления; 3 — зона растяжения (увеличение 7 X 8 и 7 X 40)

В кончике корешка лука ядра приобретают малиново-фиолетовую окраску. Ядра зоны растяжения и особенно всасывания выглядят несколько менее яркими, чем ядра зоны деления. Ядрышки, цитоплазма и оболочки клеток остаются неокрашенными.

В зерновке кукурузы ядра корешка, почечки и всех остальных тканей зародыша, а также клеток алейронового слоя окрашиваются в характерный для реакции Фельгена цвет. Сплюснутые и растянутые ядра клеток эндосперма окрашиваются более бледно.

Станьте одним из тех удачников, которые получат добротное прислуживание от самых изящных индивидуалок. Всегда соблазнительные шлюхи с вашего двора ежедневно удовлетворяют молодых людей разными способами .

Гликоген локализуется в цитоплазме клеток и играет важную роль в энергетическом метаболизме клеток. При цитохимическом исследовании гликогена используют главным образом PAS-реакцию или ШИК-реакцию (по названию реактивов — шифф-йодная кислота).

Метод Шабадаша

Под влиянием перйодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.

Посуда и оборудование

  • Химические стаканы емкостью 50 мл или кюветы.
  • Мерные цилиндры.
  • Градуированные пипетки.
  • Колбы емкостью 250 мл.
  • Воронки.
  • Горелки.
  • Термостат.
  • Весы.

Реактивы

  • 0,03 М раствор перйодата калия или натрия: 230 мг перйодата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед употреблением.
  • Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. По мере охлаждения в раствор добавляют 1 г метабисульфита калия и 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Оставляют на сутки. Для полного обесцвечивания добавляют растолченную таблетку карболена, оставляют на сутки, затем фильтруют. Реактив сохраняют в темноте (лучше на холоде) в плотно закрытой посуде. Годен к употреблению в течение нескольких месяцев (легкая степень покраснения свидетельствует о непригодности реактива).
  • Сернистая вода: к 10 мл 10 % раствора метабисульфита калия добавляют 200 мл дистиллированной воды и 10 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Готовят перед употреблением.
  • Реактив Шабадаша: к 100 мл этилового спирта добавляют 1,8 г нитрата меди, 0,9 г нитрата кальция и 10 мл формалина.
  • 1 н. раствор соляной кислоты (82,5 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 доливают дистиллированной водой до 1 л).
  • 0,1 % спиртовой раствор светло-зеленой краски (лихтгрюн).
Читайте также:  Колит в области грудной клетки с левой стороны

Ход окраски

  • Препараты фиксируют (тотчас после приготовления) в жидкости Шабадаша в течение 30 мин.
  • Промывают в двух сменах дистиллированной воды.
  • Погружают в раствор перйодата на 20 мин (в темноте).
  • Промывают в трех сменах дистиллированной воды.
  • Ополаскивают в сернистой воде (в течение 1 — 2 мин).
  • Окрашивают реактивом Шиффа в течение 30 — 40 мин (в темноте).
  • Промывают в трех сменах сернистой воды по 3 мин.
  • Промывают в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.
  • Окрашивают светло-зеленой краской в течение 10-20 с.
  • Промывают в дистиллированной воде.

Для проведения реакции удобно все растворы поместить в химические стаканчики или кюветы и переносить препараты в указанной выше последовательности.

В настоящее время существуют реагенты для цитохимического исследования на гликоген заводского производства, которые более просты в применении. К сожалению, не все из них обладают хорошим качеством.

Результат метода Шабадаша

Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый цвет на зеленом фоне препарата.

Расчет количества гликогена производят по полуколичественному методу или выражают в процентах.

Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК-положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.

Проба со слюной

Препарат помещают в свежесобранную слюну и оставляют на 30 мин в термостате. Затем производят окраску на гликоген приведенным выше методом. Инкубация препаратов со слюной способствует расщеплению гликогена, и при реакции с реактивом Шиффа не получается розовой окраски.

Идентифицировать гликоген можно также путем предварительной инкубации мазков с амилазой (1 мл профильтрованной амилазы растворить в 40 мл физиологического раствора) в течение 30 мин в термостате.

На практике проба со слюной обычно не проводится, поэтому под PAS-положительным материалом понимаются, как правило, все полисахариды, а не только гликоген.

Нормальные величины метода Шабадаша

В мазках периферической крови гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мелкой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в виде небольшого количества крупных зерен) и тромбоцитах (в виде одиночных крупных зерен). В пунктате костного мозга гликоген выявляется в нейтрофилах разной степени зрелости, лимфоцитах и мегакариоцитах.

Концентрация PAS-положительного материала в клетках гранулоцитопоэза нарастает по мере созревания клеток. Диффузное окрашивание цитоплазмы обычно свойственно наиболее молодым клеткам гранулоцитарного ряда (миелобласты, промиелоциты, миелоциты). В зрелых нейтрофилах содержится много PAS-положительного вещества в виде мелких гранул, упакованных так плотно, что цитоплазматический фон плохо различим. У здоровых людей количество интенсивно окрашенных нейтрофилов крови (+++) колеблется в пределах 2—12 %, средней интенсивности окраски (++) — в пределах 72—90%, слабо окрашенных (+) — от 4 до 18%. СЦК равен 1,71—2,04. Некоторые авторы приводят более высокие значения СЦК гликогена в нейтрофилах здоровых людей (2,485 — 2,555). У лиц пожилого и старческого возраста отмечено достоверное снижение СЦК гликогена (1,93 — 2,03).

В зрелых эозинофилах и базофилах PAS-положительный материал располагается следующим образом: специфические гранулы остаются неокрашенными и резко выделяются на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.

В моноцитах гликоген чаще выявляется в виде мелкой пылевидной зернистости на фоне светло-розового диффузного окрашивания.

В лимфоцитах крови здоровых людей гликоген содержится в виде небольшого числа гранул в 8,1 — 12,7% клеток. Некоторые авторы дают цифры от 2 до 30%.

В норме от 3 до 10% клеток эритроидного ряда содержат мукополисахариды.

В мегакариоцитах костного мозга гликоген обнаруживается в виде гранул (от единичных до 30—50), напоминая скопления кровяных пластинок. У здоровых людей число гликогенположительных мегакариоцитов составляет 58,45 — 65,55 %. В тромбоцитах PAS-положительный материал выявляется в виде мелких рассеянных гранул по периферии клетки либо в виде интенсивного центрально расположенного пятна.

Читайте также:  Норма суточного диуреза у женщин

Клиническое значение метода Шабадаша

Увеличение содержания гликогена в нейтрофилах наблюдается при различных воспалительных процессах, эритремии, сахарном диабете, уменьшение — при агранулоцитозах, лучевой болезни, хроническом миелолейкозе, особенно при прогрессировании процесса.

Повышение числа гликогенположительных лимфоцитов (до 70 — 80 %) характерно для лимфопролиферативных заболеваний, особенно хронического лимфолейкоза.

При хроническом миелолейкозе содержание гликогена в гранулоцитах уменьшается приблизительно в 2 раза по отношению к норме, хотя общее его количество, определяемое биохимическими методами, может быть даже повышенным вследствие лейкоцитоза.

При тромбоцитопенической пурпуре и симптоматических тромбоцитопениях число гликогенположительных форм мегакариоцитов значительно снижено, после спленэктомии оно повышается до нормальных величин.

При острых лейкозах гликоген можно обнаружить в бластных клетках: при остром миелобластном лейкозе в виде мелкой зернистости в цитоплазме или в виде слабого диффузного ее окрашивания, причем в части бластов PAS-реакция отрицательная. При остром промиелоцитарном лейкозе наблюдается яркое диффузное окрашивание цитоплазмы. В монобластах реакция может быть отрицательной, слабо положительной в диффузной или диффузно-гранулярной форме (когда продукт реакции выявляется в виде рассеянных мелких или средних гранул, располагающихся по краю цитоплазмы, на диффузном фоне). При эритромиелозе гликоген в виде гранул обнаруживается в эритробластах, в виде диффузного окрашивания разной интенсивности — в нормобластах. Лимфобласты содержат гликоген в цитоплазме в виде средних и крупных гранул, располагающихся венчиком вокруг ядра, иногда сливающихся в блоки, на неокрашенном фоне. Количество клеток с таким характером PAS-реакции сильно варьирует при различных случаях острого лимфобластного лейкоза.

Цитохимическое исследование на гликоген можно проводить не только в мазках крови и костного мозга. Так, например, можно исследовать мазки влагалищного эпителия и по результатам исследования судить о функциональном состоянии яичников. В норме у женщин обнаруживают много гликогена в клетках, в то время как обеднение их гликогеном свидетельствует о нарушении функции яичников.

В опухолях количество гликогена различно: зрелые доброкачественные опухоли содержат много гликогена, в незрелых раковых опухолях количество гликогена резко уменьшено. Снижение гликогена в опухолевых клетках, вероятно, может быть использовано как показатель злокачественности опухоли.

Микрофотографии ШИК-реакции:

Литература:

  • Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е. А. Кост. Москва «Медицина» 1975 г.
  • Справочник «Лабораторные методы исследования в клинике» под ред. проф. В. В. Меньшикова Москва «Медицина» 1987 г.
  • Л. В. Козловская, А. Ю. Николаев. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. Москва, Медицина, 1985 г.
  • В.Г. Палагнюк — Цитохимическая диагностика острых лейкозов.
  • Исследование системы крови в клинической практике. Под ред. Г. И. Козинца и В. А. Макарова. — М.: Триада-Х, 1997 г.

Похожие статьи

Цитохимическое исследование миелопероксидазы

Миелопероксидаза является лизосомальным ферментом, катализирующим в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. Она локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. Миелопероксидаза выявляется в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта.

Раздел: Цитохимия

Цитохимическое исследование липидов

Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).

Раздел: Цитохимия

Кольцевая проба Геллера

Кольцевая проба Геллера относится к качественным реакциям определения белка в моче. Так как она основана на реакции коагуляции, то исследуемая моча должна соответствовать определенным требованиям: быть прозрачной и иметь кислую реакцию.

Раздел: Анализ мочи

Подсчет миелокариоцитов

Для подсчета миелокариоцитов пунктат костного мозга разводят в 200 раз. Для этого к 4 мл 3 -5% раствора уксусной кислоты добавляют 0,02 мл пунктата. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и заполняют камеру Горяева. После оседания форменных элементов (через 1 — 2 мин) подсчитывают миелокариоциты в 100 больших квадратах (аналогично подсчету числа лейкоцитов в периферической крови).

Раздел: Гемоцитология

Морфология клеток мегакариоцитарного ростка

Мегакариобласты — родоначальные клетки мегакариоцитарного ряда. Размер — около 20 мкм. Ядро круглое, с мелкосетчатой структурой хроматина, иногда сплетенного в виде клубка. Структура ядра грубее, чем у недифференцированного бласта, нередко видны ядрышки. Цитоплазма базофильная, беззернистая, имеет вид узкого ободка. Часто контуры клеток неровные, с отростками цитоплазмы и образованием «голубых» пластинок.

Раздел: Гемоцитология

Ссылка на основную публикацию
Шестнадцатая неделя беременности акушерская
практикующий врач, акушер-гинеколог, гинеколог-эндокринолог, маммолог, специалист УЗД Проверено экспертами Весь медицинский контент журнала Colady.ru написан и проверен командой экспертов с...
Шевеление в левой стороне живота
Добрый день! Не пойму что это такое((Под левой грудью,только немного ниже и левее,где-то в области ребер ощущаю неприятные толчки,похожие на...
Шевеления внизу живота при беременности
О том, когда женщина начинает чувствовать шевеление плода, на что оно похоже и какая норма, читайте в нашей статье? КОГДА...
Шизоидное расстройство детского возраста
Мир человеческой психики – во многом terra incognita даже для современного уровня развития психиатрической отрасли науки. Поэтому не удивительно, что...
Adblock detector