Полимеразная цепная реакция принцип метода

Полимеразная цепная реакция принцип метода

Содержимое (Table of Contents)

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится впервые

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой многократное ферментно-опосредованное умножение (амплификацию) заданного участка ДНК длиной от десятков до нескольких тысяч пар оснований (п.о.), границы которого соответствуют коротким олигонуклеотидным последовательностям – праймерам, т.е. ПЦР представляет собой циклический синтез in vitro выбранного фрагмента ДНК. Каждый цикл состоит из трёх этапов: денатурации, гибридизации и синтеза цепи ДНК. Для выявления РНК-содержащих микробов ПЦР проводят после процедуры обратной транскрипции.

Специфичность реакции обеспечивается прежде всего правильным выбором праймеров.

По окончании реакции наличие искомого фрагмента выявляют различными методами. Наиболее распространены электрофоретическое разделение и детекция флуоресценции в режиме реального времени.

ПЦР может применяться как качественная реакция (по принципу «есть – нет»), так и как полуколичественный или количественный метод.

Для проведения анализа могут быть использованы наборы реагентов для ПЦР, зарегистрированные в установленном порядке и валидированные для соответствующих целей.

Пробоподготовка

Определяемая ДНК может быть выделена из исследуемого образца или может вноситься в реакцию без предварительной подготовки.

В первом случае следует подтвердить, что процедура выделения не влияет на результаты ПЦР. С этой целью целесообразно провести аналогичную процедуру выделения с использованием стандартного образца ДНК. Процедура выделения может быть ручной или в автоматическом режиме.

Во втором случае при внесении в реакцию тестируемого материала без проведения его предварительной подготовки, необходимо подтвердить отсутствие влияния на результаты ПЦР веществ, входящих в состав исследуемого образца. Для этого целесообразно использовать метод добавок.

Необходимо предусмотреть использование стандартных или контрольных образцов для оценки эффективности выделения нуклеиновых кислот.

Используемое оборудование, реагенты, стандартные и контрольные образцы, приготовление растворов и все этапы пробоподготовки должны быть указаны в фармакопейной статье и нормативной документации или должна быть приведена ссылка на инструкцию по применению набора реагентов для выделения ДНК/РНК.

Проведение реакции

ПЦР проводят в буферно-солевом растворе с определенным значением рН, содержащем необходимую концентрацию ионов магния, четыре вида дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и термостабильную Taq-полимеразу (ДНК-полимераза ряда микроорганизмов, например, Termus aquaticus обладает уникальным свойством сохранять активность при температуре 95°С). Состав буферного раствора, концентрацию реагентов, приготовление растворов указывают в фармакопейной статье и нормативной документации или приводят ссылку на инструкцию по применению набора реагентов для ПЦР. Реакция инициируется парой праймеров, каждый из которых представляет собой последовательность из 20-25 нуклеотидов, один праймер комплементарен последовательности ДНК с 5’-конца амплифицируемого участка, а другой – с 3’-конца. Последовательность праймеров, их концентрацию указывают в фармакопейной статье и нормативной документации.

Для оценки эффективности амплификации следует использовать положительные и отрицательные стандартные и/или контрольные образцы, указанные в фармакопейной статье и нормативной документации или в инструкции по применению набора реагентов.

ПЦР осуществляют в автоматическом режиме на специальных программируемых приборах – амплификаторах, контролирующих заданные параметры реакции: температуру и длительность отдельных этапов цикла (денатурация, гибридизация и синтез цепи ДНК), число циклов и т.д.

Денатурация. Выдерживание при температуре от 94 до 96 °С в течение установленного времени; при этом двойная цепь денатурируется (расплетается) с образованием двух одноцепочечных молекул ДНК.

Гибридизация (отжиг). При температуре 45 – 65 °С в течение установленного времени происходит гибридизация праймеров и одноцепочечной ДНК-матрицы, в процессе которого праймеры распознают комплементарные им участки матричной ДНК.

Синтез цепи ДНК (элонгация). При температуре 65 — 72 °С в течение установленного времени происходит репликация (достраивание) одной из одноцепочечных ДНК от точки связывания праймера «вправо» (для одной цепи ДНК) и «влево» (для другой цепи ДНК). В результате вновь синтезируемые молекулы ДНК становятся, в свою очередь, матрицей для аналогичного синтеза новых копий.

Продолжительность цикла составляет 0,5 — 5 мин. Сразу после окончания первого цикла процедура повторяется и происходит экспоненциальное увеличение содержания фрагментов ДНК. Обычно ПЦР состоит из 25-40 циклов. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка ДНК, приводящее к увеличению в геометрической прогрессии общего содержания продуктов реакции.

Эффективность ПЦР и количество синтезированного при этом заданного фрагмента ДНК зависит от многих факторов, среди которых следует выделить: тип и термопроводящие характеристики амплификатора, тип используемой ДНК-полимеразы, состав буферного раствора, объем реакционной смеси; длину и первичную структуру праймеров; выбранную специфическую последовательность ДНК.

Используемое оборудование и режим амплификации указывают в фармакопейной статье и нормативной документации или приводят ссылку на инструкцию по применению набора реагентов для ПЦР.

Детекция продуктов амплификации

Электрофоретическое разделение. Продукты амплификации анализируют с помощью различных методов электофореза в агарозном или полиакриламидном гелях. Для визуализации ДНК используют окрашивание интеркалирующим красителем (обычно — бромистым этидием, дающим характерное красноватое свечение при исследовании в проходящем ультрафиолетовом свете), серебра нитратом или используют мечение различными флюорохромами, дающими флюоресценцию определенной длины волны при возбуждении лазерным лучом. Для оценки размеров амплифицированных фрагментов используют маркеры и стандартные образцы.

Концентрацию геля, приготовление растворов, маркеры, стандартные образцы и условия электрофореза указывают в фармакопейной статье или нормативной документации.

Детекция флюоресценции в режиме реального времени. Способ детекции амплифицированного фрагмента с использованием флюоресцентных меток возможен при проведении ПЦР в реальном времени (Real Time PCR). Отличительной чертой данного метода, в сравнении с классической ПЦР, является возможность не только качественного (по конечной точке или в режиме «реального времени»), но и количественного определения ДНК/РНК в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза и автоматическая регистрация детектируемого сигнала.

Метод основан на измерении флуоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации. Интенсивность сигнала пропорциональна концентрации продукта ПЦР, что в сочетании с возможностью оценить кинетику процесса позволяет проводить количественное определение выбранной последовательности.

Для постановки ПЦР в реальном времени необходим амплификатор, обладающий способностью возбуждать и детектировать флуоресценцию на каждом цикле амплификации. Прибор состоит из трех блоков: амплификатора (термический блок), флуоресцентного детектора и компьютера с прилагаемым программным обеспечением.

Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют интеркалирующие красители (например, SybrGreen I) или специфические флюоресцентные зонды (например, система TaqMan). В первом варианте флюоресцентный краситель связывается с синтезируемой двухцепочечной ДНК с возникновением флюоресцентного свечения.

Во втором варианте используются ДНК-зонды, в состав которых введена флуоресцентная метка и гаситель флуоресценции. На стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и по достижении участка зонда расщепляет его, благодаря наличию 5′-экзонуклеазной активности. В результате происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к появлению детектируемого свечения.

Используемые реагенты, оборудование, условия ПЦР и программу расчета указывают в фармакопейной статье и нормативной документации или приводят ссылку на инструкцию по применению набора реагентов для ПЦР.

Оценка результатов

Полученные результаты учитывают, если одновременные испытания положительных и отрицательных стандартных или контрольных образцов дают соответственно положительные и отрицательные ответы.

При необходимости определения нуклеиновой кислоты, для которой установлено предельно допустимое содержание ДНК, следует проводить сравнение с результатом ПЦР стандартного образца с соответствующей концентрацией.

Для количественного определения специфической нуклеиновой кислоты следует использовать метод ПЦР в реальном времени и стандартный образец, аттестованный в установленном порядке.

Обеспечение качества

Используемое оборудование должно быть аттестовано в установленном порядке.

Методика на основе ПЦР для неколичественного определения должна быть охарактеризована по специфичности и аналитической чувствительности. Аналитическую чувствительность определяют как минимальное количество целевых последовательностей (ДНК/РНК) в единице объема образца, которое может быть обнаружено в 100 % образцов при 10-кратном проведении анализа или в 95 % образцов при 24-кратном проведении анализа. Количество ДНК/РНК может быть выражено в международных единицах или числом копий.

Читайте также:  Эндокринолог жалобы

Методика для количественного определения должна быть охарактеризована по специфичности, диапазону линейности, правильности и прецизионности. Для установления указанных характеристик используются соответствующие международные стандартные образцы, а также стандартные образцы, аттестованные в установленном порядке.

Стандартные и контрольные образцы

Используемые стандартные образцы должны быть аттестованы в установленном порядке, контрольные образцы – охарактеризованы по необходимым показателям. Могут использоваться стандартные и контрольные образцы набора реагентов после валидации методики.

При каждой постановке ПЦР необходимо предусмотреть использование следующих образцов:

  • положительный стандартный и/или контрольный образец, предназначенные для оценки эффективности всех этапов ПЦР, которые должны содержать определенное количество целевой последовательности;
  • положительный контрольный образец, содержащий определенное количество целевой последовательности, предназначенный для оценки этапа амплификации;
  • отрицательный контрольный образец, являющийся свободным от целевых последовательностей, для контроля отсутствия ложноположительных результатов, начиная с этапа пробоподготовки;
  • отрицательный контрольный образец, являющийся свободным от целевых последовательностей, для контроля отсутствия ложноположительных результатов на этапе амплификации.

ПЦР — это метод современных лабораторий молекулярной биологии. Если вам нужно скопировать, упорядочить или количественно определить ДНК, вам необходимо знать ПЦР. Короче говоря, полимеразная цепная реакция — это биохимический метод, использующий термоциклирование и ферменты для быстрого и надежного копирования ДНК.

Эта статья дает краткий, базовый обзор ПЦР с несколькими советами, которые помогут вам избежать наиболее распространенных ошибок. Если вы новичок или имеете мало опыта в проведении ПЦР, то статья для вас. И даже если у вас есть опыт в ПЦР, стоит его немного освежить, и, возможно, получить один или два полезных совета.

Основные ингредиенты ПЦР:

Полимераза

Полимераза — это фермент, который при правильных условиях может собирать новые цепи ДНК из матричной ДНК и нуклеотидов. Первоначальная реакция ПЦР была громоздкой, потому что высокие температуры, необходимые для денатурации ДНК, разрушали полимеразу. Это означало, что после каждого цикла нагревания новые полимеразы необходимо было добавлять в реакцию вручную — дорогостоящее мероприятие. Эта проблема решена в современных методах, так как полимеразы, используемые в современной ПЦР, обычно происходят из одного из двух термофильных источников, бактерий Thermus aquaticus или Pyrococcus furiosus. Эти полимеразы, соответственно, Taq (произносится «липкость») и Pfu (произносится «PFU»), легко выдерживают высокие температуры. Коммерческие полимеразы Taq и Pfu спроектированы с учетом скорости, точности, способность завершать длительное чтение и читать шаблоны, богатые GC. Компании постоянно выпускают новые полимеразы. Поэтому не соглашайтесь на то, «что находится в вашем морозильнике», а ищите лучшую коммерческую полимеразу для ваших нужд. Также поговорите со своим местным торговым представителем, поскольку он часто может раздавать бесплатные образцы полимеразы, чтобы вы могли решить, что лучше для вас.

Шаблон ДНК

Это ДНК, для которой вы разрабатываете свои праймеры. Это ДНК, которую ваша полимераза будет читать и копировать. Ваша шаблонная ДНК может быть геномной, плазмидной или кДНК. Чем более целостная и чистая ваша матричная ДНК, тем легче получить хорошие результаты ПЦР. Также имейте в виду, что идеальное количество ДНК будет зависеть от вашего источника, обычно 1 пг — 1 нг плазмидной ДНК или 1 нг — 1 мкг геномной ДНК на реакцию ПЦР.

Праймеры

Праймеры — это короткие фрагменты синтезированной ДНК, которые связываются с вашей шаблонной ДНК. Вам нужно будет разработать один «прямой» праймер и один «обратный». Прямой праймер обозначает начало вашей ПЦР. Последовательность этого праймера такая же, как у вашей ДНК-матрицы 5´-3´. Обратный праймер обозначает конец вашей ПЦР. Последовательность этого праймера является обратно комплементарной ДНК вашего шаблона. Обычно праймеры имеют длину 18-22 пары оснований. Однако важнее, чем их длина, является температура плавления ваших: она должна быть 54-60 ° С и максимально совпадать для обоих праймеров. Существует множество онлайн-калькуляторов, которые могут рассчитывать температуры отжига праймеров, и большинство компаний, которые синтезируют праймеры, предоставляют такие калькуляторы.

Нуклеотиды

Как мономеры ДНК, нуклеотиды необходимы для создания копий. В большинстве экспериментов вы будете использовать дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP). Вы можете купить их отдельно или в виде смеси dGTP, dCTP, dATP и dTTP. Что бы вы ни покупали, имейте в виду, что нуклеотиды очень чувствительны к циклам замораживания и оттаивания. Поэтому лучше всегда создавать небольшие аликвоты ваших dNTP. Также убедитесь, что вы храните их правильно — не используйте морозильную камеру, которая проходит автоматические циклы размораживания.

Буфер

Большинство коммерческих полимераз поставляются с идеально подобранным буфером, который обеспечивает не только правильный рН, но и всегда содержит добавки, такие как магний, калий или ДМСО, которые помогают оптимизировать денатурирование, ренатурирование и полимеразную активность ДНК.

Термоциклирование

Вот где происходит волшебство. Все вышеперечисленные ингредиенты добавляют в пробирку для ПЦР, которую затем термоциклируют. При изобретении ПЦР отдельные пробирки вручную перемещали между водяными банями с подогревом. Теперь, благодаря изобретению термоциклеров (или амплификаторов), регулирование температуры осуществляется автоматически. Ниже приведен типичный алгоритм работы амплификатора ПЦР:

  1. Инициализация

На этом этапе реакцию нагревают до 94-96°С в течение от 30 секунд до нескольких минут. Этот шаг обычно выполняется только один раз в самом начале реакции. Этот шаг важен для активации полимераз горячего старта, если вы используете такую ​​полимеразу, и для денатурации вашей шаблонной ДНК.

  1. Денатурация (повторяется 15-40 раз)

На этом этапе смесь нагревают до 94-98°С в течение 15-30 секунд. Этот шаг денатурирует вашу ДНК и праймеры, что позволит им отжигать друг друга на следующем шаге.

  1. Отжиг (повторяется 15-40 раз)

На этом этапе температура вашей реакции быстро понижается до 50-64°C в течение 20-40 секунд. Температура на этом этапе должна быть достаточно низкой, чтобы ваши денатурированные праймеры могли образовывать пары оснований с вашей шаблонной ДНК. Но достаточно высокой, чтобы могли образовываться только самые стабильные (идеально спаренные) двухцепочечные структуры ДНК. Обычно эта идеальная температура отжига на несколько градусов ниже чем температура плавления вашей пары праймеров. Также на этом этапе ваша полимераза будет связываться с вашим комплексом ДНК праймер / матрица. Полимераза не начнет чтение, пока температура не повысится на следующем шаге.

  1. Удлинение или элонгация (повторяется 15-40 раз)

На этом этапе реакционная смесь быстро нагревается до 72-80°C. В этот момент полимераза начинает чтение в направлении 5´-3´ и копировать ДНК шаблона в направлении 3´-5´. Более высокая температура на этом этапе уменьшает неспецифические взаимодействия ДНК праймера / матрицы, тем самым увеличивая специфичность реакции. Тем не менее, точная температура будет зависеть от предпочтения вашей полимеразы, поэтому перед экспериментом обязательно прочитайте инструкцию. Длина этого шага зависит от того, как долго будет длиться процесс копирования. Как правило, ДНК-полимераза может копировать 1000 пар оснований в минуту. Поэтому вам нужно выдержать смесь как минимум 1 минуту для копирования 1000 пар оснований. В конце инкубации будут созданы новые двухцепочечные фрагменты ДНК, состоящие как из матрицы, так и из новой ДНК.

Читайте также:  Melaspeel

Затем шаги 2-4 повторяют 15-40 раз

Чем больше циклов вы проведете, тем больше копий ДНК вы получите. Тем не менее, есть верхний предел. В какой-то момент доступные свободные нуклеотиды становятся ограничивающими, и преждевременно усеченные копии ДНК могут стать проблемой. Так что не жадничайте. Лучше получить меньше чистого продукта ПЦР, нежели большое количество сильно загрязненного.

  1. Окончательное удлинение

Это необязательный, но часто рекомендуемый шаг. На этом этапе реакцию проводят при 70-74°С в течение нескольких минут. Обычно вы будете использовать ту же температуру, что и на шаге элонгации. Этот шаг позволяет полимеразам завершить считывание того участка, на котором они находятся в данный момент. Этот необязательный шаг может помочь уменьшить количество усеченных копий в конечном продукте.

  1. Финальная задержка

Ваша реакция теперь завершена. Поскольку весь процесс может занять несколько часов, реакции ПЦР часто проводят в течение ночи. Рекомендуется запрограммировать ваш термоциклер на хранение продукта ПЦР при температуре 4°С до вашего возвращения. Советуем также прочесть статью о том, как провести ПЦР за 30 минут В это время вы можете проанализировать или использовать свой продукт, или перенести его в более подходящее долговременное хранилище, например, в холодильник.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе).

Многочисленные открытия в области молекулярной биологии и генетики способствовали открытию ПЦР.В 1869 г. И. Мишер выделил вещество из клеток гноя, которое содержало азот и фосфор. Изначально вещество назвали нуклеином, а когда были определены его кислотные свойства нуклеиновой кислотой.В 1944 г. были проведены эксперименты по трансформации бактерий учеными О. Эвери, К. Маклауда и М. Маккарти. В ходе этих экспериментов было доказано, что за трансформацией бактерий (приобретением болезнетворных свойств безвредной культурой в результате добавления в неё убитых кипячением болезнетворных бактерий) стоит выделенная из пневмококков ДНК.В 1952 г. учеными А. Херши и М. Чейзом был проведен эксперимент с помеченными радиоактивными изотопами ДНК и белками. В результате они выяснили, что в зараженную клетку передается только нуклеиновая кислота, а не белок, как считалось ранее.В 1949–1951 гг. были сформулированы «правила Чаргаффа». Группа биохимика Э. Чаргаффа установила количественное соотношение между различными типами азотистых оснований в составе нуклеотидов ДНК.

Правила Чаргаффа и данные рентгеноструктурного анализа Розалинд Франклин сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК. На основе этих данных в 1953 году Дж. Уотсоном и Ф. Криком был установлен принцип комплементарности. Ученые сделали вывод о том, что ДНК представляет собой двойную полипептидную цепь, образующую спираль благодаря водородным связям между азотистыми основаниями (аденин-тимин и гуанин-цитозин).В 1955 г. произошло открытие фермента ДНК-полимераза А. Корнбергом. Этот фермент способен удлинять полипептидную цепь присоединяя к 3’-концу цепи ДНК дополнительный нуклеотид. Для этого необходимо, чтобы праймер связался с цепью ДНК (матрицей) по принципу комплементарности. Чтобы реакция прошла раствор должен содержать нуклеозидтрифосфаты (дНТФ), которые используются в качестве «строительного материала». В 1971 г. Клеппе с соавторами определили состав реакционной смеси, и принципы использования ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК. Однако, из-за технологической сложности искусственного синтеза праймеров и нестабильности реакции, метод ПЦР было невозможно использовать на практике в полной мере.В 1975 г. Т. Брок и Х. Фриз открыли Thermusaquaticus (грамотрицательную палочковидную экстремально термофильную бактерию). А в 1976 г. была выделена Taq-полимераза – фермент, который способен работать при повышенных температурах (оптимум 72–80°C).В 1983–1984 гг. К. Мюллисом был проведен ряд экспериментов по разработке ПЦР. Ученый первый начал использовать вместо ДНК-полимеразы устойчивую к высоким температурам Taq-полимеразу, что позволило ускорить работу по разработке полимеразной цепной реакции. Кроме того, К. Мюллисом в соавторстве с Ф. Фалуном был разработан алгоритм циклических изменений температуры в ходе ПЦР.

Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Метод продолжает развиваться, появляются новые модификации, но мы предлагаем рассмотреть методику проведения классической ПЦР.

Методика полимеразной цепной реакции

Метод постановки ПЦР требует наличия в реакционной смеси ряда основных компонентов: праймеры, Taq-полимераза, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, буфер, анализируемый образец.

Праймеры – искусственно синтезируемые олигонуклеотиды, как правило, размером от 15 до 30 нуклеотидов, которые идентичны соответствующим участкам ДНК-мишени. Играют ключевую роль в амплификации, образуя продукты реакции.

Для полимеразной цепной реакции последовательности праймеров очень важны, потому что реакционный цикл имеет определенные величины температур, используемые на этапах нагрева и охлаждения.

Кроме того, большой избыток праймеров в реакционной смеси ПЦР приводит к тому, что они с большей вероятностью сталкиваются с частично комплементарным праймером, чем с полностью комплементарной ДНК матрицой. Таким образом, следует избегать комплементарностипраймеров друг другу.

Taq-полимераза – термостабильный фермент, который обеспечивает достраивание З’-конца второй цепи ДНК по принцип комплементарности. Этот фермент довольно часто используется при проведении стандартной ПЦР.

Taq ДНК полимераза имеет оптимальную температуру репликации – 75–80°C и выдерживает длительное воздействие температур до 96°C. Таким образом, она может оставаться активной после каждого из шагов денатурации.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) – «строительный материал», который используется Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. Включает в себя дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ).

Для оптимального включения оснований в синтезируемую цепь ДНК их обычно добавляют к реакционной смеси ПЦР в эквимолярных количествах. Как правило, конечная концентрация каждого дезоксинуклеозидтрифосфата составляет 0,2 мМ.

Буфер – смесь катионов и анионов используемая в определенной концентрации, обеспечивающая оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН. Значение рН буфера колеблется от 8,0 до 9,5 и стабилизируется Трис-HCl.

Одним из компонентов буфера Taq-полимеразы является ион калия (KCl), который способствует отжигу праймеров. Буферная концентрация ионов магния является еще одним важным фактором для правильного функционирования ДНК-полимеразы. Ионы магния служат кофактором для ДНК полимеразы.

Анализируемый образец – вносимый в реакционную смесь препарат, обычно содержащий искомую ДНК, служащую мишенью для амплификации. В случае отсутствия ДНК-мишени продукт не образуется.

Иногда для удобства детекции или контроля эффективности в состав реакционной смеси могут быть внесены дополнительные компоненты.

Внутренние контроли – несвойственный данному организму фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный специфическими праймерами. Практически представляет собой альтернативную матрицу ПЦР и позволяет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке.

ДНК-зонды – искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера (около 30 нуклеотидов), комплементарные специфическим ампликонам (продуктам реакции). Могут использоваться для детекции продуктов ПЦР, благодаря прикрепленным к ним изотопным или флуоресцентным меткам.

Для улучшения результатов ПЦР используются различные ПЦР добавки. Эти компоненты способны понижать температуру денатурации матрицы или стабилизируют ДНК-полимеразу.

Обычно используемые ПЦР-добавки включают диметилсульфоксид (ДМСО), сульфат аммония, полиэтиленгликоль, бычий сывороточный альбумин (BSA), желатин, N-триметилглицин и глицерин.

Если в пробе имеется искомая ДНК, с ней происходит ряд последовательных цикличных реакций, которые различаются температурными режимами.

Амплификация может включать в себя множество циклов, но все они состоят из трёх этапов: денатурация, отжиг, элонгация [1].

Денатурация – процесс перехода двухнитевой формы ДНК в однонитевую из-за разрыва водородных связей между комплементарными парами оснований при воздействии высоких температур.

Читайте также:  Можно ли делать ингаляции при гриппе

Отжиг – процесс присоединения праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени. Отжиг происходит благодаря правилу комплементарностиЧаргаффа. Без соблюдения этих условий праймеры не отжигаются.

Элонгация (синтез). Taq-полимераза достраивает вторую цепь ДНК с 3’-концапраймера.

Температура в реакционной смеси доводится до оптимума работы Taq-полимеразы. Затем она максимально эффективно начинает синтезировать вторую цепь ДНК от 3’-конца праймера, который связан с матрицей, и продвигается в направлении от 3’ к 5’ концу.

Результатом ПЦР будет экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, описываемое формулой

где А – количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации; М – начальное количество ДНК-мишеней; n – число циклов амплификации.

Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.

Помимо классического варианта ПЦР существует также множество других вариантов постановки ПЦР, которые направлены на решение многих задач: увеличение эффективности реакции и снижения риска образования неспецифических продуктов; реализацию возможности проведения качественного и количественного анализа искомых участков молекулы ДНК/РНК [2].

В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространенными модификациями ПЦР являются:

ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) – суть этой модификации состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения условий, которые обеспечивают специфический отжиг праймеров.

В момент постановки ПЦР полимеразная активность фермента блокируется антителами или небольшими молекулами типа Affibody, имитирующими антитела, до наступления первой денатурации (при 95°C в течение 10 минут).

ПЦР с «горячим» стартом дает возможность минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR) – предназначен для амплификации, выделения или идентификации последовательности РНК. Сперва проводят синтез одноцепочечной молекулы ДНК (кДНК), с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), используя для матрицы мРНК. Затем образовавшуюся кДНК используют для последующей ПЦР.

Возможность использовать РНК в качестве мишени для ПЦР расширяет спектр применения метода, например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирусы гриппа, ВИЧ и т.д.) представлены именно РНК.

ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» (End-point PCR) – эта модификация позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирку. Таким образом, решается проблема контаминации ампликонами. Однимизвариантовявляетсяметод «FLASH» (FLuorescentAmplification-basedSpecificHybridization – специфическая гибридизации в процессе амплификации с ДНК-зондами, меченными флуорофорами).

ПЦР в режиме «реального времени» (Real-Time PCR, ПЦР-РВ) – используется одновременно для амплификации и измерения количества искомой молекулы ДНК. Преимущество состоит в возможности совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце после каждого цикла амплификации в реальном времени.

Для этого используются флуоресцентные красители, которые интеркалируют в двуцепочечные молекулы ДНК или модифицированные дезоксинуклеоты, флуоресцирующие после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР – амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке одновременно. Преимущество этого метода заключается в возможности выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т.д., поместив проб в одну пробирку.

Все перечисленные виды ПЦР не могут быть проведены без необходимого пространства и оборудования.

Организация ПЦР-лаборатории и необходимое оборудование

Организация ПЦР-лаборатории и необходимый список оборудования регламентированы Методическими указаниями (МУ 1.3.2569–09) «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности». Комплект необходимого оборудования для проведения ПЦР должен включать в себя все необходимые приборы для выделения НК, их амплификации и детекции результатов. Все оборудование должно быть исправным, иметь технический паспорт и инструкцию по эксплуатации. Все приборы должны соответствовать нормам безопасности.

Для предотвращения контаминации исходных образцов используют одноразовые пробирки с плотно закрывающимися крышками и наконечники к микродозаторам, термостаты с твердотельнымтермоблоком, специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок. Смена наконечников является обязательной после каждой проведенной манипуляции [3].

Для каждого отдельного помещения предусмотрено наличие холодильников и морозильников для поддержания определенной температуры, вортексов и ротаторов для перемешивания, центрифуг различной мощности для перемешивания и разделения образцов. Также необходимо наличие комплекта дозаторов различного диапазона объемов и подходящих для них наконечников, штативов для микропробирок, самих микропробирок (центрифужных, градуированных и пр.) различных объемов. Все комнаты должны быть оснащены бактерицидными рецикуляторами для дезинфекции воздуха при помощи УФ, все рабочие поверхности и наружные поверхности корпусов приборов должны быть устойчивы к дезинфекции. Помимо перечисленного списка каждая зона лаборатории должны содержать конкретный набор приборов, необходимых для выполнения соответствующих задач.

Организация зон лаборатории представлена на схеме [4].

Зона приема, регистрации и первичной обработки материала должна быть оборудована центрифугами для осаждения и разделения компонентов проб.

В зоне выделения НК необходимо наличие:

• абактериального бокса для защиты исследователя от патогенных агентов, передающихся воздушно-капельным путем;

• процессора магнитных частиц для экстракции НК;

• нанофотометра для определения количества и качества выделенной из образка ДНК/РНК;

• термостата для поддержания постоянной температуры в пробирках, помещенных в гнезда термоблока;

• дистиллятора для получения дистиллированной воды.

• Зона приготовления реакционной смеси и проведения ПЦР должна содержать:

• амплификатор, необходимый для нагрева/охлаждения пробирок;

• бокс для стерильных работ для обеспечения защиты от контаминации при выделении ДНК и подготовке реакционной смеси.

1 – зона приема, разбора и первичной обработки материала;

2 – зона подготовки проб и выделения НК;

3 – зона приготовления реакционных смесей, проведения ОТ и ПЦР;

4 – зона детекции результатов методом электрофореза и ГиФА;

5 – комната анализа результатов;

7 – комната обеззараживания материала.

Обязательными для зоны детекции результатов являются:

• камера для электрофореза – разделения продуктов амплификации нуклеиновых кислот, а также источник питания, преобразующий переменный ток в постоянный;

• система гель-документации для регистрации результатов и воспроизведения электрофореграмм, включающая в себя трансиллюминатор для детекции результатов в УФ спектре, а также компьютер;

• электронные прецизионные весы для приготовления агарозного геля, который используется при электрофорезе;

• электрическая плитка для тех же целей.

В последней, но немаловажной зоне дезинфекции материалов необходим паровой стерилизатор для обработки образцов водяным паром под давлением.

Состав оборудования может варьировать в зависимости от размера лаборатории и других факторов.

Метод ПЦР находит применение в различных областях диагностики. Его применяют для выявления в клинических образцах вирусов, бактерий, простейших, а также для обнаружения приобретенных и врожденных генетических нарушений и идентификации личности [5].

Автоматизация этапов денатурации, отжига и элонгации с применением современного оборудования позволяет упростить проведение анализа и способствует его широкому применению в различных областях диагностики. Однако повсеместное внедрение данного метода ограничивается необходимостью ручной и трудоемкой подготовки проб идетекции результатов, а также необходимостью в оснащенной лаборатории со всеми необходимыми реактивами и оборудованием.

Сфера применения полимеразной цепной реакции в дальнейшем будет расширяться, т.к. все чаще в клинической практике имеют дело с очень небольшим количеством исследуемого материала, анализ которого возможен только этим методом.

Появление все новых видов ПЦР способствует охвату большего спектра возможностей для применения метода, упрощает и ускоряет его проведение, тем самым позволяя получить наиболее точный, верный и быстрый результат.

Ссылка на основную публикацию
Полезность арахиса жареного
Арахис – травянистое растение высотой 30-50 см, относится к зернобобовым. Сходство с орехами определяется семенами: составом, высоким содержанием жиров, сравнительно...
Покраснение и шелушение крайней плоти
Вы можете быть обеспокоены, если заметите сухость кожи на половом члене, но в большинстве случаев этот признак не говорит о...
Покраснение на головке у ребенка 5 лет
У детей часто бывают диагностированы заболевания наружных половых органов. От этого не застрахованы ни мальчики, ни девочки. Баланапостит – это...
Полезность сыворотки
Содержание статьи: Я увлекаюсь правильным питанием и стараюсь максимально сбалансировать свой рацион. В прошлом году меня заинтересовала польза сыворотки из...
Adblock detector